飼料中霉菌污染檢測(cè)方法探討

　　飼料在加工、貯運(yùn)過(guò)程中極易受霉菌污染，飼料一旦霉變，不僅其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值會(huì)降低，適口性會(huì)破壞，而且霉菌毒素會(huì)直接危害動(dòng)物和人類的健康，甚至導(dǎo)致死亡，因此霉菌及霉菌毒素污染所造成的損失已引起人們的高度重視。霉菌(mould)不是一個(gè)分類學(xué)上的名稱，而是某些絲狀真菌的俗稱，指在基質(zhì)上長(zhǎng)成具有絨毛狀、棉絮狀或蜘蛛網(wǎng)狀的菌絲體的真菌，一般泛指毛霉、根霉、曲霉、青霉、鐮刀菌等屬真菌。近年來(lái)世界各國(guó)紛紛制訂霉菌及霉菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)加強(qiáng)對(duì)霉菌檢測(cè)技術(shù)的研究，并不斷完善該項(xiàng)技術(shù)。我國(guó)在GB13078-91中公布了對(duì)我國(guó)部分飼料原料中霉菌總數(shù)的允許量、限用量反禁用量，檢測(cè)方法依照GB13092-91，但在實(shí)際檢驗(yàn)工作中，發(fā)現(xiàn)了不少問題。飼料生態(tài)區(qū)系具有多樣性和復(fù)雜性的特點(diǎn)，我國(guó)飼料中霉菌污染又比較普遍，因此對(duì)霉菌檢測(cè)方法的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文根據(jù)檢驗(yàn)中出現(xiàn)的問題，結(jié)合國(guó)內(nèi)外有關(guān)研究的最新進(jìn)展，對(duì)霉菌檢測(cè)的接種方式、培養(yǎng)時(shí)間等問題作幾點(diǎn)探討。

　　1 接種方式

　　常用的微生物接種方式主要有傾注法和涂布法兩種。目前國(guó)標(biāo)方法中采用傾注法，然而有實(shí)驗(yàn)和報(bào)道證實(shí)，霉菌計(jì)數(shù)采用涂布法更合適。對(duì)霉菌計(jì)數(shù)來(lái)說(shuō)，涂布法有以下幾萬(wàn)面優(yōu)越于傾注法：①在作上更容易：傾注法要求將培養(yǎng)基熔化之后涼至45℃再注入培養(yǎng)皿中，但實(shí)際上在稀釋菌液的同時(shí)，很難控制溫度。如果培養(yǎng)基溫度太高則可能使霉菌孢子受熱損傷甚至死亡，同時(shí)如果樣品已經(jīng)稀釋而培養(yǎng)基溫度仍很高，則有可能使稀釋液保持時(shí)間太長(zhǎng)。如果溫度太低時(shí)傾倒，培養(yǎng)基會(huì)凝固。如果在大批量進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)，則更難于掌握溫度。②涂布法培養(yǎng)所需的時(shí)間較短，培養(yǎng)出的霉菌菌落數(shù)較多，霉菌孢子、菌落形態(tài)特征發(fā)育完全，便于鑒定。這是因?yàn)榻^大多數(shù)霉菌是好氧的，在培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)快，發(fā)育好，而混在培養(yǎng)基中發(fā)育就受影響。③由于涂布法是先倒好培養(yǎng)基，后接種，因而可以知道培養(yǎng)基是否染上雜菌。因此，霉菌計(jì)數(shù)采用涂布法既準(zhǔn)確又省時(shí)。

　　2 培養(yǎng)時(shí)間

　　對(duì)飼料霉菌的檢測(cè)時(shí)間，國(guó)標(biāo)中采用培養(yǎng)3d后開始觀察，應(yīng)培養(yǎng)觀察1周。我們發(fā)現(xiàn)，正常培養(yǎng)條件下，許多樣品在培養(yǎng)3d后已經(jīng)無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，尤其是含有生長(zhǎng)特別快、菌絲很多的菌如毛霉、根霉、木霉等樣品和濕度較大的樣品時(shí)，則必須提早觀察記錄，在48 h以內(nèi)計(jì)數(shù)，否則菌絲就會(huì)覆蓋整個(gè)平皿，無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)3～4d的菌落數(shù)與5～7d的基本相同，因此，飼料中霉菌計(jì)數(shù)，培養(yǎng)2d就應(yīng)開始觀察，如果只是計(jì)數(shù)，培養(yǎng)2～4d已基本達(dá)到目的，但如果還要進(jìn)一步分類鑒定，則需要培養(yǎng)更長(zhǎng)的時(shí)間( 7～14 d)。

　　3 培養(yǎng)基

　　國(guó)標(biāo)中霉菌檢測(cè)使用的是高鹽察氏培養(yǎng)基(CAO)，這種培養(yǎng)基僅適合于高滲性霉菌生長(zhǎng)，所以嚴(yán)格說(shuō)來(lái)，在此培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌數(shù)并不是真正的霉菌總數(shù)。但由于飼料中產(chǎn)生毒素的真菌，主要是曲霉屬、青霉屬和鐮刀菌屬，其中許多菌種是適應(yīng)高滲的，因此，選用高鹽察氏培養(yǎng)基還是具有一定代表性的。有時(shí)為了確切地反映樣品中真菌的全貌，還可同時(shí)選用低滲性培養(yǎng)基，如馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基;為了分離某種類型或特定的產(chǎn)毒真菌，也可用選擇性培養(yǎng)基。

　　4 培養(yǎng)溫度

　　國(guó)標(biāo)中采用的溫度為(25～28±1)℃。大多數(shù)霉菌的最適生長(zhǎng)溫度為25～30℃，但一些產(chǎn)曲霉毒素的菌株則需要更高的溫度，如黃曲霉最適生長(zhǎng)溫度為35℃，構(gòu)巢曲霉為33℃，煙曲霉為37℃，因此，培養(yǎng)溫度應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況做適當(dāng)調(diào)整。

　　5 計(jì)數(shù)范圍

　　霉菌菌落由孢子和菌絲組成，相當(dāng)擴(kuò)散，在直徑9cm的平皿里，菌落數(shù)稍多就相互交重疊，影響計(jì)數(shù)，但數(shù)量太少又會(huì)產(chǎn)生較大的誤差，因此選擇適當(dāng)?shù)南♂尪扔?jì)數(shù)是保證結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，國(guó)標(biāo)中計(jì)數(shù)范圍中采用30～100顯然不太合適，大部分飼料樣品檢測(cè)中含50～100個(gè)菌落已較難計(jì)數(shù)，因此，應(yīng)盡量選擇10～50個(gè)/平皿的稀釋度進(jìn)行霉菌計(jì)數(shù)。而對(duì)含有菌絲很豐富、菌落特別擴(kuò)散的毛霉、根霉、犁頭霉等菌株，則應(yīng)在更少的范圍內(nèi)計(jì)數(shù)(30個(gè)/平皿以內(nèi))，以確保計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。

　　6 霉菌檢測(cè)中應(yīng)注重對(duì)污染菌相的分析

　　霉菌種類很多，但能產(chǎn)生霉菌毒素的只限于少數(shù)的產(chǎn)毒霉菌，而產(chǎn)毒菌種也只有少量菌株能產(chǎn)生具有危險(xiǎn)性數(shù)量的霉菌毒素，因此僅對(duì)霉菌總數(shù)進(jìn)行檢測(cè)并不能全面反映其危害程度，重要的是要知道污染菌的菌相，才能更好地判斷被污染的飼料的安全程度。關(guān)于我國(guó)飼料中的菌相分析，這些年來(lái)已初步取得結(jié)果，我國(guó)飼料(糧)中常污染的霉菌有黃曲霉、雜色曲霉、變異曲霉、米根霉、青霞等，其中尤以黃曲霉和雜色曲霉為常見。國(guó)外有些研究者設(shè)計(jì)出各類選擇性培養(yǎng)基，可以識(shí)別產(chǎn)毒的霉菌。如AFPA培養(yǎng)基(配方：酵母提取汁20g，蛋白胨10g，檸檬酸鐵銨0.5 g，0.2%二氯硝基本胺1.0mL，瓊脂15g，0.2%二氯硝基苯胺1.0mL，PH值為5.6)可以用于分離黃曲霉毒素產(chǎn)生菌。產(chǎn)黃曲霉毒素的菌株黃曲霉和寄生曲霉在AFPA上30℃培養(yǎng)2～3d就形成背面有亮橙黃色的特征性菌落，非常容易識(shí)別。有人利用該培養(yǎng)基分離黃曲霉高污染食品花生、玉米等，取得了滿意的結(jié)果。因此，針對(duì)不同樣品，有目的地設(shè)計(jì)出相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基，以篩選污染菌中的危險(xiǎn)菌群，將是一個(gè)值得探索的方向。

　　7 總結(jié)

　�、倥囵B(yǎng)時(shí)間：為避免飼料樣品中含有生長(zhǎng)特別快、菌絲很多的菌，霉菌計(jì)數(shù)必須在48 h以內(nèi)開始觀察，否則菌絲就會(huì)覆蓋整個(gè)平皿，無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)數(shù);如果只作霉菌計(jì)數(shù)，培養(yǎng)2～4d已基本達(dá)到目的;如果要進(jìn)一步分類鑒定，則需要培養(yǎng)更長(zhǎng)的時(shí)間(7～14 d)。

　　②接種方式：霉菌接種采用涂布法比傾注法更合適。

　�、塾�(jì)數(shù)范圍：應(yīng)盡量選擇10～50個(gè)/平皿的稀釋度進(jìn)行霉菌計(jì)數(shù)。而對(duì)菌絲很豐富、菌落特別擴(kuò)散的菌株，則應(yīng)在更少的范圍內(nèi)計(jì)數(shù)(30個(gè)l平皿以內(nèi))。

　�、芘囵B(yǎng)溫度(25～28±1)℃已經(jīng)可以滿足要求，特殊來(lái)源的飼料應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況做適當(dāng)調(diào)整。

　�、輧H對(duì)霉菌總數(shù)進(jìn)行檢測(cè)并不能全面反映其危害程度，更重要的是要知道污染菌的菌相，才能更好地判斷被污染飼料的安全程度。