豬圓環(huán)病毒2型疫苗及其效力檢驗(yàn)方法淺析

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豬圓環(huán)病毒2型疫苗及其效力檢驗(yàn)方法淺析

何葉峰 孫石靜 繆芬 芳劉怡 董彥鵬 胡靜雅 何海蓉

（江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司，江蘇江陰214405）

[摘要]  國(guó)內(nèi)現(xiàn)有豬圓環(huán)病毒2型（Porcine Circovirus2，PCV2）疫苗有6種，由于PCV2發(fā)病后癥狀不明顯、不死亡，傳統(tǒng)的免疫攻毒方法操作繁瑣，對(duì)于如何判斷PCV2疫苗效力眾說(shuō)紛紜，本文就PCV2疫苗的效力檢驗(yàn)與臨床應(yīng)用等方面進(jìn)行論述，以期為正確判定疫苗效力提供參考。

[關(guān)鍵詞]豬圓環(huán)病毒2型；效力；檢驗(yàn)方法

豬圓環(huán)病毒�。≒CVD，Porcine circovirus disease）是指由PCV2所引起的豬傳染病，臨床表現(xiàn)癥狀多種多樣，如斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）、豬皮炎腎病綜合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）、豬呼吸道疾病綜合征（Porcine respiratory disease complex，PRDC）、繁殖障礙、新生仔豬的先天性震顫等，其中，PMWS、PDNS和繁殖障礙在臨床上最為常見(jiàn)。本病于1991年在加拿大被發(fā)現(xiàn)，相繼北美、歐洲、亞洲等全球所有養(yǎng)豬國(guó)家均有報(bào)道，國(guó)內(nèi)1999年首次在北京、河北等地檢測(cè)到病毒^[1~3]，隨后多個(gè)實(shí)驗(yàn)室分離到PCV2；流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)表明PCV2在豬場(chǎng)抗原陽(yáng)性率達(dá)到了55.3%~78.3%^[4~6]。

疫苗是防控PCVD最經(jīng)濟(jì)有效的手段，在PCVD防制中起到了重要作用。從2010年開(kāi)始在國(guó)內(nèi)取得生產(chǎn)批準(zhǔn)文號(hào)并上市的PCV2產(chǎn)品有勃林格、南農(nóng)高科等10多個(gè)廠(chǎng)家生產(chǎn)的疫苗（見(jiàn)表1），另外還有英特威、梅里亞、碩騰、韓國(guó)komipharm等幾個(gè)公司的產(chǎn)品已在國(guó)外銷(xiāo)售，尚未在國(guó)內(nèi)取得文號(hào)。根據(jù)抗原種類(lèi)分為全病毒滅活疫苗和基因工程亞單位疫苗2種，全病毒滅活疫苗毒株來(lái)源主要為當(dāng)前國(guó)內(nèi)流行株，如南農(nóng)高科的圓克清（SH株）、武漢科前的科圓寧（WH株）、哈爾濱維科的LG株等產(chǎn)品；基因工程亞單位疫苗有勃林格公司桿狀病毒表達(dá)的Cap蛋白。流行病學(xué)調(diào)查顯示，主要流行毒株的基因型從2a亞型逐步過(guò)渡為2b亞型，這可能是PCV2流行普遍的原因；大部分試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明2a與2b亞型疫苗在臨床應(yīng)用上效果沒(méi)有明顯差異，但也有個(gè)別報(bào)道2b亞型的保護(hù)效果更好^[7]。

PCVD臨床表現(xiàn)沒(méi)有豬瘟、藍(lán)耳等疫病那么明顯，主要是破壞動(dòng)物機(jī)體的免疫系統(tǒng)，引起嚴(yán)重的免疫抑制，從而導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降，常與副豬、藍(lán)耳等多種疫病協(xié)同發(fā)病，所以其造成的危害無(wú)法用很直觀的數(shù)據(jù)來(lái)描述，需要進(jìn)行長(zhǎng)期跟蹤臨床試驗(yàn)來(lái)確定其效力，這也是鑒定豬圓環(huán)疫苗效力的難點(diǎn)。不同生產(chǎn)廠(chǎng)家采用不同實(shí)驗(yàn)室方法來(lái)確定PCV2疫苗的效力，沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)或者方法，給用戶(hù)選擇疫苗造成很大的困擾。

表1. 國(guó)內(nèi)商品化PCV2疫苗及特點(diǎn)

1. 抗原檢測(cè)方法

PCV2疫苗效力主要通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)來(lái)判斷疫苗免疫效果，其中實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)分為檢測(cè)抗原或蛋白含量、免疫后抗體效價(jià)以及攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)。

通過(guò)抽提、凍融等方法，將疫苗中的抗原成分與佐劑分離，然后以?shī)A心ELISA、免疫膠體金、western-blot等方法來(lái)確定抗原量，勃林格公司產(chǎn)品以?shī)A心ELISA方法對(duì)抗原定量來(lái)確定疫苗效力，前提是以試驗(yàn)證明其抗原量與免疫效力的相關(guān)性研究；免疫膠體金和western-blot方法可大致判定抗原含量，但試驗(yàn)證明上述方法可因不同的血清或單克隆抗體導(dǎo)致結(jié)果差異比較大，另外疫苗的免疫效果不僅僅與抗原量有關(guān)，也與疫苗生產(chǎn)工藝、滅活劑尤其是佐劑有很大的關(guān)系。

2.抗體檢測(cè)方法

抗體檢測(cè)方法主要有IFA、ELISA、IPMA、免疫膠體金與中和抗體等。IFA方法一直是經(jīng)典的抗體檢測(cè)方法，早在2002年國(guó)內(nèi)蘆銀華^[8]等人就利用IFA方法來(lái)檢測(cè)PCV2抗體，進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。王忠田^[9]、琚春梅^[10]等利用表達(dá)的重組融合蛋白作為抗原，建立了檢測(cè)PCV2抗體的間接ELISA方法，該方法的建立為我國(guó)PCV2的診斷與監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)參考。劉長(zhǎng)明^[11]等人建立了PCV2的IPMA檢測(cè)方法，并組裝試劑盒進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。研究結(jié)果表明，用IPMA檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型人工感染豬血清，第3～10周抗體陽(yáng)性檢出率為92.8%，對(duì)照組豬血清抗體檢測(cè)均為陰性。與其他幾種豬病毒參考血清無(wú)交叉反應(yīng)，與用重組蛋白抗原建立的rcELISA符合率為89.2%。 IFA、IPMA及免疫膠體金等方法暫無(wú)商品化產(chǎn)品，目前 PCV2商品化的ELISA檢測(cè)試劑盒有瑞普、科前、韓國(guó)金諾、荷蘭百測(cè)（BIOCHEK）等。吳華偉^[12]等對(duì)國(guó)內(nèi)5種試劑盒進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5種試劑盒的特異性均在90%以上，但敏感性差異較大（57%~100%），符合率較差（僅為63.2%），進(jìn)口試劑盒敏感性可能更高。而不同檢測(cè)方法之間在敏感性和特異性等方面也有差異。以上檢測(cè)方法均用于檢測(cè)豬血清抗體。

由于國(guó)內(nèi)無(wú)商品化SPF豬，而且PCV2野毒感染比較普遍，很多非免疫豬自然感染下有高低不同的抗體，很難找到PCV2陰性豬，臨床效力檢驗(yàn)中無(wú)法區(qū)分抗體是由疫苗免疫還是自然感染產(chǎn)生，因此不能把抗體的高低作為判定疫苗免疫效果好壞的指標(biāo)。SPF小鼠作為最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，是理想的動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑹o(wú)外源干擾，能比較客觀地反映疫苗免疫后的抗體水平，董信田等^[13]建立了檢測(cè)小鼠PCV2抗體ELISA方法，并與免疫攻毒保護(hù)相關(guān)。相比其他抗體檢測(cè)方法，中和抗體具有中和病毒、抑制病毒增殖、促使病毒被機(jī)體免疫系統(tǒng)清除等功能，可以確切地反映疫苗的免疫效果。

3.免疫攻毒試驗(yàn)

王先煒等^[14]通過(guò)攻毒保護(hù)試驗(yàn)來(lái)確定PCV2（SH株）滅活疫苗效力，疫苗免疫數(shù)周后攻毒，觀察動(dòng)物體溫變化、食欲、精神狀態(tài)等臨床發(fā)病情況，并對(duì)肺、淋巴結(jié)等組織器官進(jìn)行免疫組化，根據(jù)細(xì)胞中是否有PCV2抗原來(lái)判斷疫苗是否有效；由于其需要攻毒及免疫組化，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備、動(dòng)物房和試驗(yàn)技術(shù)等要求比較高，國(guó)內(nèi)少部分高校可以進(jìn)行。另外，ZJ/C株采用小鼠免疫后攻毒，采取脾臟，研磨后進(jìn)行病毒分離，由免疫組及對(duì)照組的分離率來(lái)判定疫苗的免疫效力。

4.臨床使用效果

Park C等^[15]進(jìn)行了PCV2疫苗臨床使用效果的觀察發(fā)現(xiàn)疫苗免疫后豬群生產(chǎn)性能有較大提高，包括提高增重情況、降低發(fā)病率、死淘率，母豬流產(chǎn)、死胎等；另外還可通過(guò)料肉比、用藥成本、總成本、出生后仔豬母源抗體等各項(xiàng)數(shù)據(jù)來(lái)判斷疫苗免疫效果。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，不同豬場(chǎng)的各項(xiàng)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的差異也不盡相同，在PCV2、藍(lán)耳、副豬等多種疫病頻發(fā)豬場(chǎng)，疫苗免疫后可降低發(fā)病率、死淘率及治療成本；而在亞健康豬場(chǎng)，疫苗免疫后可能在提高料肉比、日增重、降低成本等方面有較為明顯的體現(xiàn)。

Darwich等^[16]發(fā)現(xiàn)動(dòng)物感染野毒后出現(xiàn)病毒血癥，隨著抗體產(chǎn)生，病毒逐步被清除；疫苗免疫后產(chǎn)生抗體利于動(dòng)物對(duì)病毒的清除，減少病毒血癥的發(fā)生或者是縮短病毒在體內(nèi)的帶毒時(shí)間，馮志新等^[17]建立了熒光定量PCR方法來(lái)對(duì)鼻腔拭子或者血液樣品進(jìn)行檢測(cè)，可用于病毒血癥的監(jiān)測(cè)。SeoHW等^[18]通過(guò)免疫種公豬，然后以熒光定量PCR的方法監(jiān)測(cè)精液中病毒的載量來(lái)判斷疫苗免疫的效果。

隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)�；�的發(fā)展趨勢(shì)，很多集團(tuán)公司對(duì)豬圓環(huán)疫苗的質(zhì)量越來(lái)越重視，組建實(shí)驗(yàn)室或者與當(dāng)?shù)馗咝？蒲袉挝缓献饔酶鞣N試驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)疫苗的效力，應(yīng)慎重選擇試驗(yàn)的方法，并進(jìn)行科學(xué)的認(rèn)證，切忌盲從。

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