當(dāng)前位置: 首頁 > 技術(shù) >

【獨家】飼用木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

來源:互聯(lián)網(wǎng)
日期：2013-10-21
編輯：admin
評論：0條

摘要：采用DNS法對木聚糖酶的一些酶學(xué)性質(zhì)進行了研究。結(jié)果表明：該酶的最適反應(yīng)pH為4.5，在pH3.5~10.0范圍內(nèi)能保持較高的活性。最適反應(yīng)溫度為50℃，熱穩(wěn)定性不高，該酶在動物胃及腸道中活性較高。

關(guān)鍵詞：木聚糖酶；酶學(xué)性質(zhì)；穩(wěn)定性

木聚糖酶(xylanase)是指可將木聚糖降解成低聚糖和木糖的一組酶的總稱，主要包括外切β-1,4-木聚糖酶、內(nèi)切β-1,4-木聚糖酶和β-木聚糖酶^[1]。木聚糖酶在飼料、食品、造紙、紡織、醫(yī)藥及能源等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。作為飼用酶制劑，木聚糖酶可以有效消除木聚糖的抗營養(yǎng)作用，促進畜禽對粗飼料的消化吸收；作為新型的紙漿漂白助劑，木聚糖酶能降低漂白用氯，解決紙漿工業(yè)中的環(huán)境污染問題；木聚糖酶水解植物中的半纖維素，形成的戊糖進一步用于生產(chǎn)木糖醇、酒精、有機酸等產(chǎn)品，在可再生資源生物轉(zhuǎn)化利用中具有重要作用^[2]。

本實驗室前期篩選得到了一株高效降解木聚糖的菌株^[3]，本次試驗將對該菌株固體發(fā)酵產(chǎn)的木聚糖酶進行酶學(xué)性質(zhì)的研究，包括最適反應(yīng)pH、pH穩(wěn)定性、最適反應(yīng)溫度、熱穩(wěn)定性及耐受胃蛋白酶胰蛋白酶的能力等進行了測定，以期對該木聚糖酶有更為深入的認識，對該木聚糖酶的應(yīng)用有一定的指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 木聚糖酶由本實驗室固體發(fā)酵獲得。

1.2 試劑

燕麥木聚糖（X0627）、胃蛋白酶（P7000）、胰酶（T1005）均購自sigma公司。DNS試劑參見GB/T 23874-2009中DNS的配置方法。其余試劑為分析純。

1.3 酶活測定方法

采用DNS分光光度法測定，具體方法參見GB/T 23874-2009。酶活定義：在37℃、pH為5.50的條件下，每分鐘從濃度為5 mg/mL的木聚糖溶液中降解釋放1 μmol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位U。

2 試驗設(shè)計

2.1 木聚糖酶的最適反應(yīng)pH

分別用0.1 mol/L的不同pH（2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0）的緩沖液（pH≤8.0的用磷酸二氫鈉－檸檬酸緩沖液，pH＞8.0的用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液）^[4]配制木聚糖底物，按國標測定酶活，以酶活最高者為100%，在其他條件下的酶活占最高酶活的百分數(shù)即為在此pH條件下的相對酶活。

2.2 木聚糖酶的pH穩(wěn)定性

取等量酶液分別加入等量的上述不同pH（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0）的緩沖液，混勻后，在37℃水浴保溫4 h，冰水浴冷卻后按國標測定酶活。以酶活最高者為100%。

2.3 木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度

用最適pH的緩沖液配置溶液，在30、40、45、50、55、60、65和70℃不同的溫度下反應(yīng)，按國標法測定酶活。以酶活最高的溫度為最適反應(yīng)溫度。

2.4 木聚糖酶的熱穩(wěn)定性

用最適pH的緩沖液配置溶液，在50、55、60℃不同的溫度下處理10、20、40、60、80、100、120 min，按國標法測定酶活。以未處理酶的酶活為100%。

2.5 胃蛋白酶和胰酶對木聚糖酶活性的影響

在0.5 mL木聚糖酶溶液中，分別加入0.5 mL濃度為0.01 mg/mL的胃蛋白酶溶液（用pH2.0，濃度為0.01 mol/L的HCl溶液配置）和0.5mL濃度為0.2 mg/mL胰酶（用pH7.0，濃度為0.1 mol/L的磷酸二氫鉀緩沖液配置），在37℃水浴分別處理30、60、90 min，按國標法測定酶活。以未處理酶的酶活為100%。

3 結(jié)果與分析

3.1 木聚糖酶的最適反應(yīng)pH

在不同pH緩沖液中測定酶活力見圖1。由圖可知，該酶的酶活變化趨勢符合鐘形曲線。隨著pH的升高，酶活呈現(xiàn)上升趨勢，在pH4.5時達到最高。隨后開始下降，在pH4~5.5之間可保持80%以上的活性。在pH為3.0時仍有50%以上的活性。在pH5.5以后酶活急劇下降，當(dāng)pH為8.0時酶活僅為最適pH時的7.3%。

3.2 木聚糖酶的pH穩(wěn)定性

由圖2可知，37℃保溫4h，該木聚糖酶在pH2.0~10.0之間都具有很好的穩(wěn)定性。其中在pH2.0~3.5之間，酶活保留率在73.0%~90.0%之間；在pH3.5~10.0之間，酶活保留率在90%以上。

3.3 木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度

不同溫度下測定木聚糖酶的活性，結(jié)果見圖3。由圖可知，其最適反應(yīng)溫度在50℃，在40~55℃之間可保持有70%以上的酶活，當(dāng)高于55℃時酶活急劇下降，70℃時酶活僅有1.9%的酶活。

3.4 木聚糖酶的熱穩(wěn)定性

木聚糖酶在不同溫度下處理不同時間后的剩余酶活，結(jié)果見圖4。由圖可知，該木聚糖酶的熱穩(wěn)定性隨溫度的升高呈線性下降。該木聚糖酶在50、60、70℃處理10min后，酶活保留率從92.6%急劇下降至13.6%。該酶在50℃處理120min后，酶活保留率只有67.3%，而在60、70℃處理120min后，酶活保留率分別僅有10.0%和2.5%。

3.5 胃蛋白酶和胰酶對木聚糖酶活性的影響

37℃下用胃蛋白酶和胰酶處理木聚糖酶不同時間后的剩余活性見圖5。由圖可知，木聚糖酶對胃蛋白酶和胰酶有很好的抗性，經(jīng)胃蛋白酶和胰酶90min處理后的木聚糖酶酶活分別還剩75%和90%以上，并且在實驗條件下胃蛋白酶和胰酶處理時間長短對木聚糖酶的穩(wěn)定性基本沒有影響。

圖5 胃蛋白酶和胰酶對木聚糖酶活性的影響

4 討論

本文研究的該木聚糖酶最適pH值和最適溫度與其他關(guān)于木聚糖酶的報道相近。pH穩(wěn)定范圍較廣，在pH3.5-10.0范圍內(nèi)能保持較高酶活。雖然熱穩(wěn)定不夠高，但可通過包被技術(shù)使木聚糖酶在制粒的過程中避免酶活損失。該木聚糖酶對胃蛋白酶和胰酶有很好的抗性，較其他報道的木聚糖酶有著巨大的優(yōu)勢^[5]。因此，該木聚糖酶在飼料中的應(yīng)用具有很好的應(yīng)用前景。

參考文獻：

[1] Christov L P, Prior B. Esterases of xylan-degrading microorganisms: Production, properties and significance[J]. Enzyme Microb Technol, 1993, 15: 460~475.

[2] Viikarii L, Kantelinen A, Sundqvist J et al. Xylanases in bleaching: from an idea to the industry[J]. FEMS Microbiol Rev, 2001, 13: 335~350.

[3] 周平發(fā)，王敏，崔細鵬等。飼用木聚糖酶菌株的篩選[J]。飼料與畜牧，2012，4：13~14。

[4] 周先碗。生物化學(xué)儀器分析與實驗技術(shù)[M]。北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003，316-319。

[5] 楊會濤，陳代文，田剛等。木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)研究[J]。中國畜牧雜志，2007，43（21）：57~60。

相關(guān)閱讀: