單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)在臨床獸醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

    摘　要：單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)是一種簡便、快速、靈敏的檢測真核細(xì)胞DNA損傷與修復(fù)的方法。其基本原理是將單個(gè)細(xì)胞包理于瓊脂糖凝膠中進(jìn)行裂解、電泳、熒光染色和顯微鏡觀察，細(xì)胞DNA損傷產(chǎn)生的斷鏈或碎片在電泳中遷移形成典型的“慧星”圖像，根據(jù)遷移長度和熒光強(qiáng)度即可定量分析DNA損傷的程度。該文總結(jié)了該實(shí)驗(yàn)技術(shù)的基本原理、檢測方法及其在臨床獸醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用前景。

　　關(guān)鍵詞：單細(xì)胞凝膠電泳；DNA損傷；臨床獸醫(yī)學(xué)

　　單細(xì)胞凝膠電泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE)是由Ryberg B和Jonhanson K J首先提出[1­2]，后又經(jīng)Singh N P[3]和Olive P I[4­5]進(jìn)一步完善的一種在單細(xì)胞水平上檢測DNA損傷與修復(fù)的方法。因其細(xì)胞電泳形狀頗似彗星，又稱慧星試驗(yàn)(comet assay)。它是一種測定和研究單個(gè)細(xì)胞DNA鏈斷裂的新電泳技術(shù)，與傳統(tǒng)方法相比，其簡便、快速、靈敏、樣品量少、無需放射性標(biāo)記，具有極高的實(shí)用價(jià)值。目前該技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于體內(nèi)、體外各種有核細(xì)胞經(jīng)受試物誘導(dǎo)的DNA損傷和修復(fù)的研究。在1999年舉行的國際基因毒性檢驗(yàn)程序?qū)ｎ}學(xué)術(shù)討論會中，此方法被定為確定某物質(zhì)是否具有基因毒性的最佳方法[6]。本文就該技術(shù)的原理、操作程序和方法作一簡介，并預(yù)測其在臨床獸醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用前景。

　　1　SCGE的原理

　　SCGE是一種在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)的方法，其確切機(jī)理目前尚不清楚。一般來說，有核細(xì)胞的DNA分子量很大，DNA負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)附著在核基質(zhì)中，用瓊脂糖凝膠將細(xì)胞包埋在載玻片上，在細(xì)胞裂解液作用下，細(xì)胞膜、核膜及其他生物膜破壞，使細(xì)胞內(nèi)的RNA、蛋白質(zhì)及其他成分進(jìn)入凝膠，繼而擴(kuò)散到裂解液中，惟獨(dú)核DNA仍保持纏繞的環(huán)區(qū)(Loop)附著在剩余的核骨架上，并留在原位。

　　如果細(xì)胞未受損傷，電泳中核DNA因其分子量大停留在核基質(zhì)中，經(jīng)熒光染色后呈現(xiàn)圓形的熒光團(tuán)，無拖尾現(xiàn)象。若細(xì)胞受損，在電泳液(pH8)中，核DNA仍保持雙螺旋結(jié)構(gòu)，偶有單鏈斷裂(SSBs)并不影響DNA雙螺旋大分子的連續(xù)性。只有當(dāng)DNA雙鏈斷裂(DSBs)時(shí)斷片進(jìn)入凝膠中，電泳時(shí)斷片向陽極遷移，形成熒光拖尾現(xiàn)象，形似彗星。如果在堿性電泳液(pH＞13)中，先是DNA雙鏈解螺旋且堿變性為單鏈，單鏈斷裂的碎片分子量小即可進(jìn)入凝膠中，在電場力作用下細(xì)胞核中帶負(fù)電荷的DNA斷鏈或碎片離開核DNA在凝膠中向陽極移動，形成“彗星”狀圖像。細(xì)胞核DNA受損愈重，產(chǎn)生的斷鏈或堿易變性斷片就愈多，其斷鏈或斷片也就愈小，在電場作用下遷移的DNA量多，遷移的距離長，表現(xiàn)為尾長增加和尾部熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。因此，通過測定核DNA遷移部分的光密度或遷移長度，就可定量測定單個(gè)細(xì)胞DNA損傷程度。

　　2　SCGE實(shí)驗(yàn)程序和方法

　　至今，SCGE技術(shù)在世界上許多實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，操作上進(jìn)行了許多改良，并不斷地融進(jìn)新技術(shù)。但是，最常用的還是堿性SCGE方法，下面就其基本操作程序做簡要介紹。

　　2.1　細(xì)胞處理

　　細(xì)胞在電泳前一般先做DNA損傷的誘導(dǎo)處理，現(xiàn)今有70多種處理劑，如輻射因素、各種氧化劑、烴化劑、抗癌藥、誘變劑、農(nóng)藥、重金屬、環(huán)境因素(煙霧、高溫、低溫、粉塵等)及藥物。處理方式(體內(nèi)或體外)及處理時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究目的而定。

　　2.2　制備細(xì)胞懸液

　　從理論上講，一切活的有核細(xì)胞均可進(jìn)行SCGE實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞可來自人、動物和植物的組織分離細(xì)胞或培養(yǎng)的細(xì)胞系，分離純化制成單細(xì)胞懸液，用臺盼藍(lán)法測定細(xì)胞存活率＞95%，細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL～5×106個(gè)/mL，備用。

　　2.3　制片

　　選用的載玻片宜薄不宜厚，單面加水磨沙應(yīng)均勻細(xì)密，鋪膠分為3層。第1層，在磨沙面上滴加正常熔點(diǎn)瓊脂糖(溶于不含Ca2＋、Mg2＋的PBS液中；56 ℃)，此層的目的是加強(qiáng)凝膠對玻片的附著，防止膠片脫落。第2層為含細(xì)胞(約105個(gè))的低溶點(diǎn)瓊脂糖(37 ℃)，第3層是不含細(xì)胞的低溶點(diǎn)瓊脂糖，此層膠的目的是對第2層細(xì)胞起保護(hù)作用。

　　2.4　細(xì)胞裂解

　　移去膠板上的蓋玻片，將膠板浸入預(yù)冷的裂解液中(2.5 mol/L NaC1、100 mmol/L Na2EDTA、10 mmol/L Tris­HCl、1%肌氨酸鈉、用前加1% TritonX­100和10 mL/L DMSO),4 ℃裂解至少1 h，使細(xì)胞裂解，DNA松散。

　　2.5　DNA解旋與電泳

　　裂解后取出玻片，用冰冷的PBS緩沖液漂洗3次后置于水平電泳槽內(nèi)，加入新配制的堿性電泳液(1 mmol/L Na2 EDTA、300 mmol/L NaOH；pH13)至蓋過膠面約2 mm～3 mm，使DNA解螺旋20 min(4 ℃)，DNA充分展開，之后，電泳20 min～40 min(25 V,300 mA,4 ℃)。

　　2.6　中和與染色

　　電泳后取出載玻片，用中和液(0.4 mol/L Tris­HCl，pH 7.5)將膠板浸沒20 min或滴洗4次，每次5 min。近來有報(bào)道中和后再用無水乙醇或甲醇處理，可明顯增強(qiáng)DNA的熒光強(qiáng)度，每張膠板上滴加20 mL～100 mL染色劑(如叮啶橙、溴化乙錠、碘化丙錠)，染色2 min～20 min。應(yīng)盡快閱片，時(shí)間過長將導(dǎo)致熒光淬滅。以上各步驟應(yīng)在黃光或紅光下或暗室中操作。

　　2.7　圖像分析

　　在熒光顯微鏡下，觀察單細(xì)胞電泳圖象，每片記數(shù)25個(gè)～50個(gè)細(xì)胞，每組2張～3張玻片。觀察方法有目鏡測微尺直接測量、顯微照像后用兩腳規(guī)測量、圖像分析儀進(jìn)行分析。DNA損傷的測量參數(shù)有，尾長(tail lenth)是損傷DNA遷移的長度在低損傷劑量范圍內(nèi)與損傷呈線性關(guān)系，尾部DNA密度，與損傷程度有關(guān)；尾矩(tail moment)是尾長與尾部DNA百分含量之乘積，在高損傷劑量下與損傷程度呈線性關(guān)系；尾塊(tail local)是“彗星”尾部分散的大小不一的DNA斷片組成，與損傷程度有關(guān)；尾慣量(tailinertina)是與每個(gè)尾塊的面積、平均熒光強(qiáng)度、在X軸上與“彗核”中心距離有關(guān)的綜合性指標(biāo)。

　　隨著彗星試驗(yàn)方法的不斷改進(jìn)，各種彗星試驗(yàn)試劑盒也應(yīng)運(yùn)而生，使試驗(yàn)進(jìn)一步簡化。

　　3　SCGE技術(shù)在臨床獸醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用前景

　　近年來，SCGE技術(shù)在國際上應(yīng)用發(fā)展較快，由于它具有簡便、快速、靈敏、需樣品量少、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，預(yù)期在臨床獸醫(yī)學(xué)研究中(特別是在動物慢性中毒方面)將是一種應(yīng)用前景十分廣闊的新技術(shù)。

　　由于工農(nóng)業(yè)的蓬勃發(fā)展，環(huán)境污染日益嚴(yán)重，動物中毒病時(shí)有發(fā)生，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。慢性中毒危害嚴(yán)重，不但引起母體慢性中毒，影響其生長發(fā)育，而且對胚胎產(chǎn)生毒性造成胚胎死亡、胚胎生長緩慢、胎兒畸形和功能不全。環(huán)境污染與DNA損害關(guān)系密切，甚至導(dǎo)致癌變、畸胎，日益引起人們的關(guān)注。

　　3.1　空氣污染

　　二氧化硫(SO2)和粉塵是空氣污染中最主要的監(jiān)測指標(biāo)。孟紫強(qiáng)等[7]報(bào)道SO2能引起小鼠不同臟器(腦、肺、肝、脾、腎、腸和睪丸)及血液淋巴細(xì)胞DNA的損傷，且隨SO2濃度增加，DNA損傷加劇，并呈明確的劑量­效應(yīng)關(guān)系，隨吸入SO2濃度增加，證明SO2是一種全身性DNA損傷因子。粉塵對身體的主要危害是引起塵肺的發(fā)生，但粉塵本身的理化性質(zhì)就可能引起DNA損傷。有研究者[8]報(bào)道大氣細(xì)顆粒物能引起大鼠肺泡巨噬細(xì)胞DNA的損傷，并且隨著大氣細(xì)顆粒物濃度的增加及染毒時(shí)間的延長而加劇，呈明確的劑量­效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間­效應(yīng)關(guān)系。

　　3.2　水污染

　　地面水正受到日益嚴(yán)重的污染。在水污染嚴(yán)重的地方，其水生生物的DNA損傷也較對照地區(qū)嚴(yán)重[9]。齊寶寧等[10]應(yīng)用單細(xì)胞凝膠電泳和微核試驗(yàn)對污染指數(shù)(PI)不同的河流中采集的鯉魚的紅細(xì)胞DNA損傷進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)不同地面水水源中的鯉魚紅細(xì)胞DNA損傷情況不全相同，與陰性對照組比較差異有顯著性，與污染嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，結(jié)果與微核試驗(yàn)一致。進(jìn)一步證實(shí)通過測定水生生物DNA損傷，可以檢測地面水的污染狀況。并且蠶豆根尖微核試驗(yàn)可檢測染色體水平的損傷，而慧星試驗(yàn)所檢測的是DNA鏈的斷裂，所以將這兩種試驗(yàn)結(jié)合起來，在水環(huán)境的遺傳毒物生物監(jiān)測中具有一定的應(yīng)用前景。

　　3.3　有機(jī)試劑污染

　　室內(nèi)空氣污染給人們健康帶來的嚴(yán)重危害已受到關(guān)注，室內(nèi)裝修所使用的各種裝飾材料、油漆及涂料均可釋放出大量的苯、甲苯、二甲苯、甲醛、乙醛、丙烯醛及其他各種揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs)。特別是甲醛和苯已經(jīng)成為現(xiàn)代裝修后影響室內(nèi)空氣質(zhì)量的主要污染物。鄧艷梅等[11]探討了空氣中的甲醛對遺傳物質(zhì)DNA的斷裂損傷作用，發(fā)現(xiàn)甲醛能引起肥大細(xì)胞DNA斷裂，導(dǎo)致DNA­蛋白質(zhì)交聯(lián)產(chǎn)生，誘發(fā)哮喘的發(fā)生。這可能是體內(nèi)自由基升高，直接氧化肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂釋放出組織胺，產(chǎn)生過敏反應(yīng)有關(guān)[12]。張美榮等[13]研究發(fā)現(xiàn)苯可致小鼠外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷，明顯影響小鼠脾臟、胸腺淋巴細(xì)胞DNA和RNA合成而產(chǎn)生遺傳毒性作用。這可能是因?yàn)楸皆隗w內(nèi)代謝過程中自由基形成增多，自由基在DNA損傷中發(fā)揮重要作用。隨著濃度的增高，DNA損傷加重。這也有助于解釋苯致白血病的發(fā)生。

　　3.4　金屬、非金屬及其化合物的污染

　　Ge Y M等[14­15]應(yīng)用SCGE研究了NaF對DNA的損傷作用，以確定氟是否具有遺傳毒性，研究發(fā)現(xiàn)，NaF對DNA具有損傷作用，并且存在劑量­反應(yīng)關(guān)系，顯示氟具有誘變性，可引起染色體斷裂，導(dǎo)致染色體畸變；也提示氟可能具有潛在致癌性。這對于在高氟地區(qū)進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測提供了新思路。薛蓮等[16]應(yīng)用慧星試驗(yàn)再次證實(shí)了鎘對中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞DNA具有明顯的損傷作用(出現(xiàn)DNA單鏈斷裂)，其損傷程度隨染毒劑量的增加而加重，呈明顯的劑量­效應(yīng)關(guān)系，而鋅具有明顯的頡頏作用。鄭玉建等[17]用SCGE法檢測氟砷單獨(dú)及聯(lián)合對人淋巴細(xì)胞DNA損傷作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)砷和氟單獨(dú)均能引起淋巴細(xì)胞DNA單鏈斷裂，并且低劑量氟與砷聯(lián)合作用時(shí)，則呈現(xiàn)協(xié)同作用。因此可將SCGE作為一種早期、實(shí)用的指標(biāo)應(yīng)用于氟、砷及SO2等接觸生物群體的DNA損傷監(jiān)測。

　　4　SCGE技術(shù)展望

　　SCGE技術(shù)與以往的DNA斷裂檢測技術(shù)相比，具有明顯優(yōu)勢。①適用范圖廣，檢測譜寬。與經(jīng)典的染色體畸變、微核、SCE相比，SCGE適用于體內(nèi)外各種實(shí)驗(yàn)，凡是能制成單細(xì)胞懸液的各種真核細(xì)胞(包括水生生物細(xì)胞、植物細(xì)胞等)均可用于SCGE測試。②簡便與快速。SCGE法無需復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，所需試劑為實(shí)驗(yàn)室常用藥品且耗費(fèi)低，從采樣到結(jié)果分析只需數(shù)小時(shí)，為現(xiàn)場調(diào)查和大樣本量分析提供了可能。③靈敏性好�？梢詸z測到每1.657×10－17kg中0.1個(gè)DNA的斷裂，甚至檢出自然光照射體外淋巴細(xì)胞1 h引起的DNA損傷，與SCE、UDS相比具有更高的敏感性，它可能與32P后標(biāo)記檢測DNA加合物的靈敏度一致，被認(rèn)為是低水平輻射(0.05Gy)檢測的快速、敏感方法。④所需細(xì)胞樣本量少。一般每個(gè)樣品只需1 000個(gè)細(xì)胞。⑤與蔗糖密度梯度離心法、DNA堿解螺旋法、中性或堿性濾膜洗脫法、DNA黏度測量法相比，SCGE無需放射性標(biāo)記，方便易行。⑥本法還能檢測非增殖細(xì)胞的DNA損傷。單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)，廣闊的應(yīng)用前景無可非議，方法學(xué)自身的拓展方興未艾，相信該技術(shù)將在臨床獸醫(yī)學(xué)中得到推廣使用。