高效液相色譜法測(cè)定飼料中磺胺喹惡啉方法研究

高效液相色譜法測(cè)定飼料中磺胺喹惡啉方法研究

磺胺喹惡啉屬磺胺類抗生素兼有抗球蟲作用，廣泛用于養(yǎng)禽業(yè)，其口服后吸收迅速，但排泄緩慢，殘留在組織器官及雞蛋中時(shí)間長(zhǎng)，人食用后，對(duì)人體產(chǎn)生耐藥性等副作用。世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定動(dòng)物組織、奶的最高殘留限量(MRL)值為100μg/kg。日本等國(guó)規(guī)定肉雞中不得檢出。因此，該藥的使用應(yīng)嚴(yán)格控制用藥期及用藥量，以保證產(chǎn)品的安全及對(duì)外貿(mào)易暢通。
　　據(jù)英國(guó)獸藥典記載，磺胺喹惡啉純品為黃色粉末，幾乎無味，不溶于水，溶于甲醇、乙醇，易溶于堿性溶液。目前，飼料中磺胺喹惡啉的檢測(cè)方法美國(guó)AOAC標(biāo)準(zhǔn)是采用分光光度法，該法要求含阿散酸及不含阿散酸的飼料采用兩種不同的測(cè)定方法。而國(guó)內(nèi)飼料目前添加組分較復(fù)雜，檢測(cè)者對(duì)飼料情況是未知的，難以確定用哪一個(gè)方法；且該方法中需要重氮化試劑做偶合反應(yīng)，其毒性大，對(duì)操作者及環(huán)境都會(huì)造成危害。因此，我們沒有采用該法。另外，還有文獻(xiàn)報(bào)道用氣相色譜法測(cè)定，中間仍需重氮化衍生。我們最終選用高效液相色譜法。
　　
　　1.測(cè)定方法 
　　1.1原理 用甲醇水溶液提取飼料中的磺胺喹惡啉，離心，過濾，在HPLC儀上分離,紫外檢測(cè)器240nm處測(cè)定。
　　1.2 試劑和溶液
　　以下所用的試劑，除特別注明外均為分析純?cè)噭�；水為蒸餾水，色譜用水符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。
　　1.2.1 磺胺喹惡啉標(biāo)準(zhǔn)品：含磺胺喹惡啉(C14H12N4O2S) 95.0％。
　　1.2.2 甲醇：色譜純。
　　1.2.3 磷酸鹽溶液：取磷酸二氫鉀3.40g和磷酸氫二鉀5.71g，加水溶解并稀釋至1000mL。
　　1.2.4 磺胺喹惡啉標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取磺胺喹惡啉(4.1)50mg，溶于甲醇并稀釋成0.1mg/mL的儲(chǔ)備液，置4℃冰箱中避光保存，有效期1個(gè)月。臨用前，取此儲(chǔ)備液用水稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。
　　1.2.5 提取液：甲醇100mL＋水50mL
　　1.3 儀器
　　1.3.1 實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備 
　　1.3.2高效液相色譜儀(配紫外檢測(cè)器)
　　1.3.3 分析天平：感量為0.0001g和0.001g
　　1.3.4 旋渦振蕩器
　　1.3.5 離心機(jī)：4000r/min
　　1.3.6針頭過濾器：備孔徑為0.45μm 微孔濾膜
　　1.4 分析步驟
　　1.4.1 提取
　　稱取5g試樣，精確至0.001g，加入提取液(4.5)50mL，旋渦振蕩器混勻，超聲水浴中提取15min，中間取出搖動(dòng)1次，然后4000r/min離心5min，靜置，取上清液過0.45μm濾膜，供液相色譜測(cè)定。
　　1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
　　準(zhǔn)確吸取儲(chǔ)備液適量，用水或流動(dòng)相稀釋成濃度分別為0.10、0.50、1.00、2.00、10.0μg/mL的磺胺喹惡啉標(biāo)準(zhǔn)溶液，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　1.4.3 測(cè)定
　　1.4.3.1 色譜條件
　　色譜柱：C18柱 柱長(zhǎng)150mm，柱內(nèi)徑4.6mm，粒度5μm或性能相當(dāng)者。
　　流動(dòng)相：磷酸鹽溶液75mL＋甲醇25mL，用前過0.45μm濾膜，并超聲脫氣。
　　流速：1mL/min。
　　檢測(cè)波長(zhǎng)：240nm。
　　進(jìn)樣量：10～20μL。
　　1.4.3.2 定性與定量
　　根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間定性，定量由標(biāo)準(zhǔn)曲線或單點(diǎn)校準(zhǔn)。
　　1.4.4 結(jié)果的計(jì)算
　　每千克試樣中含磺胺喹惡啉的質(zhì)量按下式公式計(jì)算：
   m1
x= ? ×D
   m
　　x??每千克試樣中磺胺喹惡啉的質(zhì)量(mg)；
　　m1??色譜峰面積對(duì)應(yīng)的磺胺喹惡啉的質(zhì)量(μg)；
　　D??稀釋倍數(shù)；
　　m??所稱樣品的質(zhì)量(g)。
　　平行測(cè)定結(jié)果用算術(shù)平均值表示，保留至小數(shù)點(diǎn)后1位。
　　
　　2.結(jié)果與討論
　　2. 1 色譜條件的確定
　　大多數(shù)磺胺類藥物常以磷酸/乙腈體系做為流動(dòng)相，而磺胺喹惡啉在該體系下出峰時(shí)間是56min，影響檢測(cè)效率。改用磷酸鹽/甲醇體系做流動(dòng)相。
　　通過改變磷酸鹽和甲醇的比例，磺胺喹惡啉的保留時(shí)間發(fā)生了變化。
　　
　　磷酸鹽 : 甲醇 磺胺喹惡啉保留時(shí)間 (min)
　　 70 : 30 4.86
　　 75 : 25 7.80
　　 80 : 20 12.32

　　出峰早磺胺喹惡啉與雜質(zhì)峰相互干擾，出峰晚影響檢測(cè)效率，峰形變寬。磷酸鹽與甲醇比例75:25較為合適。
　　2.2 方法線性與最小檢出限
　　對(duì)5.0、10.0、20.0、100.0 mg/kg的添加濃度按上述方法測(cè)定。

添加濃度(mg/kg) 5.0 10.0 20.0 100.0
峰面積 35906 71684 122536 771414

　　線性方程為：y=7821.8～13601.6
　　相關(guān)系數(shù)為：r=0.9992
　　方法最小檢出濃度為5.0mg/kg。磺胺喹惡啉的使用劑量雞配合飼料是60g/t，能夠檢出低于用量10倍濃度已能滿足檢測(cè)需要。
　　2.3 方法的準(zhǔn)確度與精密度
　　根據(jù)磺胺喹惡啉在配合飼料中允許使用量為60 mg/kg，取配合飼料分別制成5、60、100mg/kg的磺胺喹惡啉添加試樣，每個(gè)濃度做5個(gè)平行，提取，上機(jī)測(cè)定，計(jì)算回收率及方法變異系數(shù)。

添加量  實(shí)測(cè)值 回收率 變異系數(shù)
(mg/kg) (mg/kg) (％)  (n=5)
  5      4.5    89.4   6.7
 60     55.6    92.6   2.1
100     95.2    95.2   4.6

　　2.4 適用范圍
　　取添加劑預(yù)混合飼料及濃縮料制成添加試樣，提取，適當(dāng)稀釋上機(jī)測(cè)定。

                添加量   實(shí)測(cè)值 回收率 變異系數(shù)
                (mg/kg) (mg/kg)  (％)   (n=5)
添加劑預(yù)混合飼料  200    190.2   95.1    5.4
添加劑預(yù)混合飼料 1500   1480.6   98.7    2.1
濃縮料            100     91.5   91.5    6.2

　　總之，通過上述實(shí)驗(yàn)考查，說明該方法不僅適用于配合飼料，同樣也適用于濃縮及添加劑預(yù)混合飼料。
　　
　　3. 結(jié)論
　　通過上述實(shí)驗(yàn)考查，本方法提取操作簡(jiǎn)便、快捷，在此色譜條件下，分辨率高，干擾少，適用于配合飼料、濃縮料及添加劑預(yù)混合飼料中磺胺喹惡啉的測(cè)定。方法最小檢出濃度滿足實(shí)際監(jiān)督檢測(cè)需要，具有較好的準(zhǔn)確度及精密度。（來源：飼料廣角）