植酸酶的檢測方法

植酸酶的檢測方法

　　　　　　　廣東溫氏食品集團有限公司　　譚寶玲  陳麗  馮建文

摘要：飼用植酸酶酶活性的定量分析至今沒有普遍公認的檢測方法，本測定方法是在BASF公司1991提出的植酸酶活性的測定方法的基礎上進行研究改進，建立了更適合于普通實驗室條件下植酸酶產(chǎn)品酶活性的測定。本方法采用絕對法，取二次曲線方程計算，其線性相關性（R²）勻能夠達到0.999～1，同一樣品同一時間平行測定實驗結果相對誤差均<2%，同一樣品不同時間測定結果相對標準偏差（RSD%）<10%（n=3）。

關鍵詞：  植酸酶    測定方法

植酸酶是催化植酸水解成為肌醇與磷酸的一類酶的總稱，其在飼料中的應用得到廣泛認同，用于促進畜禽對飼料中多種營養(yǎng)成分的吸收和利用，減少畜禽飼料中植酸磷的排泄，減少環(huán)境的磷污染。植酸酶產(chǎn)品的質(zhì)量鑒定和飼料中植酸酶的添加量是飼料生產(chǎn)廠家和質(zhì)量檢測機構都要面臨的工作。商品植酸酶質(zhì)量及在飼料中的添加量的定量分析至今沒有世界公認的測定方法，被廣泛認可和使用較多的方法是Gist?brocades和BASF公司1991年提出的植酸酶活性的測定方法，但此方法在操作上仍存在不簡便，方法穩(wěn)定性不夠，測定結果誤差相對較大。經(jīng)筆者研究摸索，對BASF公司的植酸酶活性測定方法進行改進，建立了經(jīng)濟、簡便、快速、準確度較高、更適合普通實驗室的植酸酶產(chǎn)品酶活性測定方法。

1　酶活定義

　　在37.0℃、pH5.50條件下，每分鐘從0.005mol/L的植酸鈉溶液中釋放出1微摩爾的無機磷所需要的酶量，即為1個酶活單位，以FTU/g表示。

2        植酸酶樣品

本方法采用的植酸酶樣品為本公司購進的羅氏公司樂多仙植酸酶產(chǎn)品和星湖科技公司星湖酶產(chǎn)品，標示量均為≥5000FTU/g。

3　儀器設備                    

3.1　分析天平（精確至0.0001g）

3.2　紫外分光光度計

3.3　恒溫水浴鍋（能控制在37.0±0.1℃）

3.4　實驗室用秒表

3.5　移液槍：0.1～1ml移液槍，2ml移液槍（適配相應槍頭）

3.6　磁力攪拌器

3.7　離心機（4000rpm）

3.8　電熱恒溫干燥箱

3.9　玻璃試管：10ml刻度試管（13Ｘ120mm），試管（18Ｘ180mm）,10ml離心管。

4　試劑與溶液

4.1　醋酸緩沖液（0.25mol/L，pH5.50）：稱取三水合乙酸鈉30.02g于1000ml燒杯中，加雙蒸水約900ml溶解，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.50±0.05，再加3滴吐溫?20，用雙蒸水定容至1000ml，搖勻。本溶液最好為現(xiàn)配現(xiàn)用。

4.2　植酸鈉溶液（0.00761mol/L，pH5.50）：準確稱取植酸鈉0.703g（Sigma產(chǎn)品），溶于約80ml醋酸緩沖液中，用冰乙酸或氫氧化鈉調(diào)pH至5.50±0.03，再用醋酸緩沖液定容至100ml。本溶液臨用時新配。

4.3　（1+2）硝酸溶液：1體積濃硝酸與2體積雙蒸水混合。

4.4　鉬酸銨溶液（100g/L）：取四水合鉬酸銨100g，加雙蒸水約800ml溶解，加25%氨水10ml，再用雙蒸水定溶至1000ml，搖勻。本溶液室溫下避光保存，有效期3個月。

4.5　釩酸銨溶液（2.35g/L）：取偏釩酸銨2.35g于燒杯中，加雙蒸水500ml溶解，待完全溶解后，攪拌條件下緩緩加入稀硝酸20ml，待冷卻至室溫后用雙蒸水定溶至1000ml。本溶液室溫下避光保存，有效期3個月。

4.6　終止液：到鉬酸銨溶液和釩酸銨溶液各250ml于1000ml容量瓶中，用（1+2）硝酸溶液定容。本液臨用時新配。

5　操作方法

5.1　磷標準溶液及樣品溶液配制

5.1.1磷標準溶液：稱取基準磷酸二氫鉀適量于105℃干燥2h，置干燥器中冷卻至室溫后，精確稱取0.3415g于具塞錐形瓶中，加入約100ml醋酸緩沖液并稱量，準確至0.0001g,得25.0055μmol/g磷標準液。用移液器準確移取磷標準液0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.5 g、0.8 g、1 g，置于10ml刻度試管中，加醋酸緩沖液至5g（精確至0.0001g），配制成系列濃度的磷標準液： 0.5001μmol/g、1.0002μmol/g、1.5003μmol/g、2.5006μmol/g、4.0010μmol/g、5.0011μmol/g。備用。

5.1.2　樣品溶液：稱取1g植酸酶樣品于具塞三角瓶中，加醋酸緩沖液至100g并稱量（準確至0.0001g），攪拌30min后取上清液于4000rpm離心10min（或用玻璃濾紙過濾），稱取上清液0.1g，加醋酸緩沖液稀釋至100g，使得到酶活為0.05FTU/g左右的樣品溶液，所有稱量均需精確至0.0001g。

5.2　酶活反應及測定

稱取磷標準溶液、樣品溶液、空白醋酸緩沖液各1g（精確至0.0001g）于試管（18Ｘ180mm）中，按表3進行反應。樣品反應操作間隔時間為30秒。

表3 反應步驟表

反應完畢后靜置10min，再將反應溶液于4000rpm離心10min。取上清液于波長415nm測定其吸收度。根據(jù)磷標準液的反應總磷量和吸收度繪制標準曲線并求取二次曲線方程，再根據(jù)下式計算樣品酶活：

                                  P*F

                 酶活（FTU/g）= ????

　　　　　　　　　　　　　　　　　W*30

式中，P??由樣品吸收度根據(jù)二次曲線方程求得的反應總磷量，μmol；

W??樣品重量，g;

F??樣品總稀釋倍數(shù)；

30??反應時間，s。

6        結果

6.1 方法的重復性

抽取了三個批次的樣品，每個樣品進行3次不同日期的測定，結果見表1。

           表1  植酸酶產(chǎn)品中植酸酶含量的測定結果

6.2 試驗的回收率

取用丹尼斯克提供的液體標準酶產(chǎn)品，酶活性值為6320.0FTU/g，分別取0.5ml標酶進行兩次六個平行測定，回收率在100.06～110.92%之間。

7　討論

7.1 本方法采用稱量質(zhì)量來計算稀釋倍數(shù)，除去了移液器存在的誤差，提高實驗的準確性。

7.2在醋酸溶液中可適當加入氯化鈣作為表面活性物質(zhì)，增加酶的活性，對測定結果影響較小，加入量為每1000ml加無水氯化鈣0.145g。

7.3實驗中水浴的溫度是影響酶反應的重要因素，一定要控制好，最好能采用循環(huán)水流，振蕩水浴亦可，維持水溫的均衡。

7.4本方法每次實驗均要求在相同條件下同時做標準曲線，否則會增加實驗誤差。筆者用同一實驗數(shù)據(jù)采用不同的實驗標準曲線計算，植酸酶產(chǎn)品酶活性結果可相差976.65FTU/g,標準偏差（RSD%）為16.09%。

參考文獻：

1.     GB/T 18634?2002 飼用植酸酶活性的測定-分光光度法。

2.     張若寒，植酸酶的測定方法，中國飼料1997年第5期。

3.     陳小鴿，微量比色法測定飼用植酸酶活力，河南農(nóng)業(yè)科學。