大豆胰蛋白酶抑制因子（TI）的研究進展

大豆胰蛋白酶抑制因子（TI）的研究進展

劉 欣   馮 杰

(浙江大學飼料科學研究所 農(nóng)業(yè)部動物分子營養(yǎng)重點實驗室，浙江杭州 310029)

摘要：大豆胰蛋白酶抑制因子是一類小分子量的蛋白質(zhì)或多肽，對胰蛋白酶活性有抑制作用，攝入過量可導致人和動物患病。因此胰蛋白酶抑制因子被認為是大豆食品和飼料的主要抗營養(yǎng)因子，它的失活能明顯提高大豆食品與飼料的營養(yǎng)價值和食用安全性。本文綜述了胰蛋白酶抑制因子的結構、基因類型、作用機制、失活及測定方法及其應用前景。

關鍵詞：大豆；胰蛋白酶抑制劑；基因類型；失活；應用前景

大豆胰蛋白酶抑制因子（STI）是大豆中的主要抗營養(yǎng)因子之一。據(jù)報道，STI能引起各種動物生長抑制作用如引起老鼠、小雞的胰腺腫大和增生^[1,2]，還導致仔豬對日糧能量和氮的利用率降低^[3],刺激胰臟蛋白酶和糜胰蛋白酶的合成，增加體液因子（如膽囊激素）的形成和釋放^[4]。因此，鈍化大豆胰蛋白酶抑制因子對改善和提高大豆食品與飼料的營養(yǎng)價值和食用安全有重要意義。

1．大豆胰蛋白酶抑制因子的結構及其基因類型

1.1大豆胰蛋白酶抑制劑的結構  生大豆中主要有兩種胰蛋白酶抑制因子^[5]，一種是庫尼茲胰蛋白抑制因子( Kunitz soybean trypsin inhibitor,簡稱KSTI)，約占1.4％。分子量是21.384KD,內(nèi)有181個氨基酸殘基,含2個二硫鍵�；钚灾行氖蔷�氨酸63－異亮氨酸64,一個KSTI分子抑制劑能鈍化1分子的胰蛋白酶。另一種是鮑曼-貝爾克胰蛋白酶抑制因子(Bowman-Birk soybean trypsin inhibitor ,簡稱BBI)，約占0.6%,其分子量為7861D,有71個氨基酸殘基,7個二硫鍵,分子中有2個活性中心:1個是賴氨酸16-絲氨酸17,為胰蛋白酶的結合點;另一個是亮氨酸44-絲氨酸45,是胰凝乳蛋白酶的結合點。這兩種抑制因子通過結合點的作用與胰蛋白酶絡合,從而使胰蛋白酶失活,起到對昆蟲、動物及人類的抗營養(yǎng)作用。

1.2大豆胰蛋白酶抑制劑的基因類型  目前研究比較清楚的是Kunitz的基因類型。Kunitz 于1945 年由首先從大豆種子中分離Kunitz 型大豆胰蛋白酶抑制劑SBTI - A2 ,并獲得并純化結晶^[6] 。之后就展開了大量的研究表明:大豆中至少有4 種胰蛋白酶抑制劑,其中最主要的是SBTI - A2^[7] , 屬于KTi 型。Singh 等人觀察到SBTI - A2 具有電泳變異類型,Hymowitz 等人論證了大豆種子蛋白的提取物經(jīng)電泳后,出現(xiàn)Rf 值分別為0. 79 、0. 75 、0. 83 三個互為顯性的等位基因tia 、tib 、tic ,同時還存在著一種極少量的無SBTi - A2 的隱性等位基因(ti)^[8]。高越峰等(1997 ,1998) ^[9-10]從未成熟大豆子葉中,利用RT - PCR 的方法克隆到了大豆Kunitz 型胰蛋白酶抑制劑基因SKTI ,并采用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化方法獲得了轉(zhuǎn)基因煙草,獲得的轉(zhuǎn)基因煙草經(jīng)抗蟲實驗表明,具有明顯的抗棉鈴蟲能力,并且通過對照研究表明,SKTI 對胰蛋白酶活性的抑制能力明顯高于豇豆胰蛋白酶抑制劑Cp TI。忻驊等(1999) ^[11]克隆了Tid 這個新類型cDNA 全序,并在大腸桿菌中獲得了表達,在室內(nèi)條件下進行了人工飼料喂養(yǎng),初步研究了其抗蟲性。謝可方等^[12]（2002）證明大豆Kunitz 胰蛋白酶抑制劑( SBTi－A2) 大量存在于大豆種子中,屬絲氨酸蛋白酶類型抑制劑,它由4個顯性等位基因Tia , Tib , Tic及Tid編碼, 其中Tid是我國科學家于1991 年從國內(nèi)15000 余份大豆資源中發(fā)現(xiàn)的,它與Tia之間僅有一個氨基酸的差別^[5].這些基因類型的發(fā)現(xiàn)，為大豆胰蛋白酶作為生物農(nóng)藥奠定了基礎。

2 大豆胰蛋白酶抑制因子的抗營養(yǎng)機理

動物采食大豆日糧后，小腸液中的胰蛋白酶與大豆胰蛋白酶抑制因子結合，生成無活性的復合物，降低胰蛋白酶的活性，導致蛋白質(zhì)消化利用率下降.同時引起動物體內(nèi)蛋白質(zhì)的內(nèi)源性消耗，腸道中的胰蛋白酶與胰蛋白酶抑制劑結合失去活性，反饋性引起膽囊收縮素－促胰酶素（ckk-pz）的分泌增加，ckk-pz刺激胰腺發(fā)生補償性反應，分泌更多的胰蛋白酶補充至腸道，而分泌的消化酶并未用于消化蛋白質(zhì)，而是繼續(xù)與STI結合生成無活性的復合物，如此循環(huán)，導致蛋白質(zhì)的內(nèi)源性消耗。胰蛋白酶中含有豐富的含硫氨基酸，故胰蛋白酶大量補償性分泌造成體內(nèi)含硫氨基酸的內(nèi)源性損失，這加劇了因大豆及其餅粕中含硫氨基酸短缺引起的體內(nèi)氨基酸的不平衡，引起動物生長受阻或停滯，同時還可引起胰腺增生與肥大。

3 大豆胰蛋白酶抑制劑的失活方法及其檢測

3.1胰蛋白酶抑制劑的失活方法

大豆胰蛋白酶抑制因子結構中活性部位的氨基酸是其具有抑制活性的必要條件,所以其中的二硫鍵受到破壞時能使其失活。近十年來國內(nèi)外對于大豆胰蛋白酶抑制因子失活方法與技術的研究，主要在物理失活、化學失活、生物學失活等幾個方面獲得明顯的進展。

物理方法包括熱失活法、超聲波失活法和其他失活法。到目前為止,熱處理仍是消除大豆中胰蛋白酶抑制因子的主要方法。其原理是通過加熱,破壞飼料中對熱不穩(wěn)定的抗營養(yǎng)因子。馬得瑩等（2000）^[13]對大豆進行濕熱處理，認為在120℃（0.1Mpa）條件下加熱10min，大豆中的抗營養(yǎng)因子失活，并且較好地保存大豆的營養(yǎng)價值^[13]。但熱處理常常導致其中必需氨基酸(尤其是賴氨酸) 的損失和物料理化性質(zhì)的改變,從而影響飼料的營養(yǎng)價值。Sessa（1991）^[14]用30mmol的NaS₂O₅65℃處理1h，可使95％的的KSTI和98％BBI失活。但化學失活法難免存在一些化學物質(zhì)的殘留問題,從而影響食品和飼料的安全性。生物技術的迅猛發(fā)展為胰蛋白酶抑制因子的失活提供了另一種有效的方法，其原理是胰蛋白酶抑制因子可作為底物而被蛋白酶水解，從而使其活性中心結構改變而失去活性。吳非等（2002）^[15]采用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶鈍化大豆胰蛋白酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)四種酶都能不同程度的鈍化胰蛋白酶抑制劑的活性，其中堿性蛋白酶最為顯著，使胰蛋白酶抑制劑的活性降為原來的58.09％。采用酶法鈍化大豆胰蛋白酶抑制劑，比加熱法節(jié)省能源，而且還可以改善飼料蛋白的質(zhì)量。目前主要需要解決的是其應用的成本問題。

3.2大豆胰蛋白酶抑制因子的檢測方法

常用來檢測大豆胰蛋白酶抑制劑的方法是脲酶檢測法。生大豆中的脲酶與胰蛋白酶抑制因子的含量相近，變性失活的程度也與胰蛋白酶抑制因子相似，故可用脲酶活性作為大豆加工適宜程度的檢測指標。而氫氧化鉀檢測法是用來評估大豆加工過度和加工不足的最佳方法。但是這兩種方法并不能直接測出蛋白酶抑制因子的含量。所以人們開始嘗試用免疫學檢測方法來檢測胰蛋白酶抑制因子的活性。20世紀80年代Brandon等證明通過酶聯(lián)免疫吸附測定法可以檢測各種大豆產(chǎn)品中的KTI含量。Carter等（1993）嘗試用單克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測大豆中的胰蛋白酶抑制因子，并繪制了競爭性ELISA曲線。由于雜交瘤單克隆抗體成分比較單一，雜蛋白含量少，重復性好，而且雜交瘤細胞可以長期保存，隨時取用，所以具有很廣闊的應用前景。

4 大豆資源育種及其前景展望

大豆蛋白是重要的植物蛋白源，其蛋白質(zhì)含量高達約40％，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦的21世紀解決人類蛋白質(zhì)需求的主要食物資源。近年來美國對直接不含胰蛋白酶抑制劑的大豆生粉飼喂畜禽興趣很高，并收到良好的效果。但是迄今為止,我國尚未發(fā)現(xiàn)不含大豆胰蛋白酶抑制劑的基因源,丁安林等(1999) ^[16]年報道了無胰蛋白酶抑制劑的優(yōu)質(zhì)大豆新品種中豆28 ,但是它的血緣有來源于美國的大豆品種P. I. L83 - 4387。但同時大豆胰蛋白酶抑制劑還具有重要的防護功能,并且大豆胰蛋白酶抑制劑為含有豐富的含硫氨基酸,降低其含量就會降低其營養(yǎng)性,因此最好的途徑是培育或發(fā)現(xiàn)無活性胰蛋白酶抑制劑的品種,而不是統(tǒng)統(tǒng)的將胰蛋白酶抑制劑去除,這就需要我們尋找一些大豆胰蛋白酶抑制劑突變新品種。Krishnan(2001) ^{[17 ]}對一份大豆胰蛋白酶抑制劑積累含量很低的大豆品種( P. I. 196168) 做了DNA 序列分析,其編碼區(qū)發(fā)生了兩個缺失和G/ T 顛換的突變,這些突變引起4 個終止密碼子的引入,導致了不正常的截斷的無活性蛋白的形成,Northern 雜交也證明其KTi3 mRNA 積累水平在種子中很低,為我們進一步研究優(yōu)異的大豆基因源提供了一個很好的借鑒。

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